本发明公开了一种用于通过睾丸注射制备转基因动物的试剂盒。本发明的用于制备转基因动物的试剂盒,包括由聚乙烯亚胺和磁小体组成的组合物。本发明的试剂盒大大提高了转基因效率,且能获得较多数量的转基因活体后代。本发明试剂盒中组合物的毒性小,对动物安全。因此,用本发明试剂盒进行转基因操作提高了转基因动物的生产的效率,在转基因动物制备领域具有重要意义。
1.由聚乙烯亚胺和磁小体组成的组合物在制备用于制备转基因动物的试剂盒中的应用;所述聚乙烯亚胺和磁小体的质量比为0.5-1:1;所述制备转基因动物是通过睾丸注射法实现的。技术领域
本发明涉及一种用于通过睾丸注射制备转基因动物的试剂盒。
背景技术
睾丸注射法是将外源DNA直接注射到雄性动物睾丸内,使目的基因转染到各个发生阶段的生精细胞,转染有目的基因的精子经体内成熟后采用自然交配或人工授精获得转基因动物。其特点是操作简便、成本低廉且适于大量生产转基因动物。但是目前睾丸注射法获得的转基因动物的效率低,且往往不能得到活体后代。聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)具有很高的阳离子电荷密度,具有强烈的“质子海绵作用”,能从内吞作用的路径中有效破坏溶酶体并快速释放所负载的核酸,可用作基因载体。由趋磁性细菌(magnetotacticxa0bacteria)生产的磁小体(磁小体,Bacteriaxa0magneticxa0particles,BMPs)是天然的磁性纳米颗粒。其形状为平截八面体,平行六面体或六棱柱体等,成分为四氧化三铁,由磷脂,蛋白质或糖蛋白膜包裹,可保护所结合的目的基因不受各种酶的破坏,具有无毒和在磁场的作用下能沿磁力线移动和扩散的特点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于制备转基因动物的试剂盒及其使用方法。本发明所提供的用于制备转基因动物的试剂盒,包括由聚乙烯亚胺和磁小体组成的组合物。上述试剂盒中,所述聚乙烯亚胺和磁小体的质量比为0.5-1∶1。上述任一所述试剂盒中,还包括磁铁。上述任一所述试剂盒中,所述组合物的使用剂量为:所述组合物与待转基因的质量比为0.5-1∶1。上述任一所述试剂盒中,所述制备转基因动物是通过睾丸注射法实现的。本发明提供的使用上述任一所述试剂盒的方法,为将上述任一所述试剂盒中的组合物与待转基因按0.5-1∶1质量比混合后,再使用。由聚乙烯亚胺和磁小体组成的组合物在制备用于制备转基因动物的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中,所述聚乙烯亚胺和磁小体的质量比为0.5-1∶1。上述任一所述应用中,所述制备转基因动物是通过睾丸注射法实现的。本发明的最后一个目的是提供一种制备转基因动物的方法。本发明所提供的制备转基因动物的方法,包括如下步骤:将上述任一所述试剂盒中的组合物与待转基因按0.5-1∶1质量比混合后,再注射入动物睾丸,并将磁铁置于睾丸一侧以促进所述基因在睾丸组织内的渗透,得到转基因的亲本雄性动物。上述制备转基因动物的方法还可包括如下步骤:将所述转基因的亲本雄性动物与雌性动物交配,得到的仔代动物即为目的转基因动物。上述中的聚乙烯亚胺的重均分子量为25000。本发明的试剂盒大大提高了转基因效率,且能获得较多数量的转基因活体后代。本发明试剂盒的毒性小,对动物安全。因此,用本发明试剂盒进行转基因操作提高了转基因动物的生产的效率,在转基因动物制备领域具有重要意义。
附图说明
图1为经睾丸注射的成年小鼠活体成像(箭头所指为实验组小鼠睾丸部位报告基因(绿色荧光蛋白,GFP)所发荧光)。图2为PCR分析GFP在睾丸注射组仔鼠基因组内的表达。1-16号为睾丸注射仔鼠,M表示marker。目的DNA片段大小为310bp(白色箭头所示)。图3为RT-PCR分析GFP在睾丸注射组仔鼠基因组内的表达。1-16号为睾丸注射仔鼠,M表示marker。目的DNA片段大小为310bp(白色箭头所示)。图4为睾丸注射鼠仔代小鼠活体成像。A:自然光成像照片。1-3,5-7号均为仔代小鼠,4号为对照组。B:活体荧光成像照片。动物编号与A中动物依次对应。其中绿色(弱)至红色(强)均表示该部位组织表达GFP荧光。图5为PCR分析GFP在显微注射仔鼠基因组内的表达。1-18号为显微注射仔鼠基因组DNA;阳:表达GFP质粒DNA;阴:未进行任何注射的小鼠基因组DNA。图6为RT-PCR分析GFP在显微注射仔鼠基因组内的表达。1-18号为显微注射仔鼠基因组DNA;阳:表达GFP质粒DNA;阴:未进行任何注射的小鼠基因组DNA。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。下面以转入GFP基因为例,说明制备转基因动物方法。聚乙烯亚胺(PEI)购自上海贺宝化工有限公司,产品目录号为H226065。磁小体(BMP)的制备方法:可用现有方法制备得到。具体可按照已公开的国家专利(公开号:CN101376900;专利名称:一种恒化高密度培养趋磁细菌高产磁小体的方法)制备磁小体(BMP)。带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA购自上海吉玛制药技术有限公司,产品目录号为F-07。实施例1、制备转基因动物一、BMPS-PEI-DNA复合物的准备:取适量BMP在超声振动仪中短暂混匀10-20s,然后迅速放置冰上,如此反复几次直至BMP充分分散混匀后,加入等质量的PEI,并再次在超声振动仪中短暂混匀10-20s。之后加入带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA(BMPS:PEI:质粒DNA=0.5∶0.5∶1,g/g/g)并再次充分混合后,用玻璃注射针吸取适量的BMPs-PEI-DNA混合液备用。二、雄性动物睾丸内BMPs-PEI-DNA混合液的注射:将雄性动物麻醉后固定,术部消毒。打开腹腔,找到睾丸并拉至腹腔外,固定睾丸。沿睾丸纵轴用1mL无菌注射器针头(22G)刺破睾丸被膜。然后将吸有BMPs-PEI-质粒DNA混合液的玻璃针沿此创口刺入睾丸组织深部后,边回针边注射BMPs-PEI-DNA混合液。注射完毕后用灭菌纱布包裹睾丸,并不断滴加37°C生理盐水,同时将1cm直径的灭菌磁铁片置于睾丸一侧,放置30min以促进质粒DNA向组织深部的渗透,转移。对侧睾丸做相同处理。每只雄性动物的注射体积以动物睾丸组织的体积为参考,总体上以注射结束后不溢出睾丸为宜。以小鼠为例,每侧睾丸大约需注射30μL混合液(约含70ngxa0DNA)。注射完毕后,将动物睾丸复位,缝合腹部切口。三、手术后动物单独饲养4周,之后将其与发情雌性动物合笼。确认动物怀孕后隔离饲养,直至其产仔。四、转基因阳性小鼠检测一般在仔代动物离乳后进行检测和验证。1、绿色荧光验证利用带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA表达绿色荧光蛋白特点,通过荧光背景观察,从动物整体水平检测转基因是否阳性以及确定阳性表达所在的组织或器官。实施时,将仔代动物麻醉后使用脱毛剂脱毛,置于活体荧光照相系统下,如果机体某些器官或组织表达该质粒,则经过450~490nm蓝光激发,可检测到绿色荧光。2、PCR检测进一步验证。将步骤1中检测阳性的动物进一步进行PCR检测。PCR的模板是小鼠尾部组织DNA。PCR反应所需的引物序列和PCR反应体系分别见表1和表2。表1,转基因检测所用引物序列ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表2xa0xa0PCR反应体系ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="700"/>PCR反应条件:94°C预变性5min;94°C变性50Sec,59°C退火30Sec,72°C延伸1min,35个循环,72°C7min,充分延伸,4°C20min。之后做琼脂糖凝胶电泳,确认PCR产物片段大小是否为预期大小,并切去目的条带凝胶回收用于基因测序,以确认基因序列。3、RT-PCR检测进一步验证采用常规方法提取鼠尾总RNA,经反转录获得cDNA作为模板DNA,用于RT-PCR检测。检测所用引物与PCR反应体系所用相同。具体反应体系见表3。表3PCR反应体系ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>反应条件:94°C预变性5min;94°C变性50S,55°C退火30S,72°C延伸1min,35个循环,72°C7min,充分延伸,4°C20min。之后做琼脂糖凝胶电泳,确认PCR产物片段大小是否为预期大小,并将目的条带凝胶回收用于基因测序以确认基因序列。满足如下条件中的至少一种的即为阳性转基因动物:1)检测到绿色荧光;2)PCR检测阳性;3)RT-PCR检测阳性。对照组:用国际上最常规的原核显微注射方法。以睾丸注射所使用的同一种含有GFP质粒DNA溶液作为外源基因,将原核注射法获得的受精卵移植后,获得仔鼠,提取鼠尾DNA和RNA,进行PCR鉴定和RT-PCR鉴定。五、结果本发明方法从3只雄鼠中检测获得了2只(66.7%)表达质粒DNA的雄鼠,即原代动物转基因效率达到了66.7%。活体荧光显示实验组公鼠睾丸处可见到有GFP表达,而对照组没有GFP表达(图1)。经与正常母鼠交配繁殖,我们对本发明方法所生产的所有仔鼠进行了DNA(图2)和RNA(图3)水平的检测。睾丸注射组共得到16只仔鼠,提取鼠尾DNA和RNA,分别做PCR检测后发现3、4、6、7、8、11、12、13号,共8只小鼠DNA中整合有目的基因片段,RT-PCR检测结果与PCR及活体荧光所对应动物结果一致,阳性率为8/16≈50%。睾丸注射鼠仔代小鼠活体成像显示,PCR和RT-PCR检测阳性或者阴性的仔鼠目的基因在仔代小鼠的不同部位有不同程度的表达(图4)。与对照组4号比,编号为1、2、5和6号仔鼠(分别对应电泳图中3、4、6和7号仔鼠)有表达,而编号为3和7(分别对应电泳图中9和10号仔鼠)未检测到荧光。据此说明活体成像所得实验结果与分子生物学检测所得结果一致。对照组:将135枚原核注射法获得的受精卵移植后,获得18只仔鼠,分别做PCR检测。发现其中4、5、6、7、9、13、14、16和17号共9只小鼠DNA中整合有目的基因片段,其体内均检测到GFP表达,如图5和图6所示,阳性率为9/135≈7%。实验共重复3次,结果均一致。我们将本发明方法所得实验结果与采用脂质体等其它试剂盒进行转基因动物制备的效率进行了比较,结果显示本试剂盒在转基因效率提高方面具有明显优势(表4)。在原核注射法实验中,我们总共将135枚受精卵移植给受体鼠,获得了9只GFP阳性的基因敲减转基因小鼠,其总的转基因效率为7%(使用该方法普遍的转基因效率为5~10%)。而本发明的睾丸注射法获得转基因小鼠阳性率高达50%。从操作的简便性、成本、获得转基因动物的效率等方面看,睾丸注射法所获得的效率均优于传统方法,具体见表5。表4xa0xa0睾丸注射法转基因研究对比简表ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表5xa0xa0磁小体试剂盒介导睾丸注射法与显微注射法制备转基因小鼠比较ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>当用如下组合物进行睾丸注射时,转基因效率与实施例1中的实验组无显著差异。该组合物中,BMPS∶PEI=0.5∶1(g/g),BMPS与PEI之和与质粒DNA的质量比为0.5∶1。